miércoles, 22 de abril de 2015

Practica 3: Tinción de Gram

Universidad Autónoma de Chiapas
Facultad de Ciencias Químicas Ext. Ocozocoautla

INTEGRANTES DEL EQUIPO
*      Ariana Archila Jimenez
*      Catherin C. Pérez Sánchez
*      Yeudiel Pérez López
*      Emmanuel López


CATEDRATICO
Dra. Ana Olivia Cañas Urbina


SEMESTRE:
Segundo
MATERIA
       Biología Celular 


NOMBRE DEL TRABAJO
Practica 3 de Laboratorio de Biología Celular

TINCION DE GRAM
El peptidoglicano o mureina es un copolímero formado por una secuencia alternante de N-acetil-glucosamina y el Ácido N-acetilmuramico unidos mediante enlaces -1,4. El peptidoglucano es muy resistente y protege a las bacterias de una ruptura osmótica en ambientes acuáticos y da a los tipos diferentes de bacterias sus formas.
La cedan es recta y no ramificada. Constituye la estructura básica de la pared celular de la pared celular de las eubacterias y de las Prochlorophyta. Las arqueobacterias, al contrario no poseen mureina sino pseudopeptidoglucano formado por N-acetil-glucosamina unida al N-acetiltalosaminomuramico mediante enlace -1,3.

MUREINA Y TINCION DE GRAM
GRAM POSITIVO
*     La red de mureina está muy desarrollada y llega a tener hasta 40 capas.
*     Los aminoácidos que lo forman son distintos entre especies.
*     Esta constituido de la estructura química de la mureina es característica de la especie y constituye un buen parámetro taxonómico.
*     Los aminoácidos L-diaminopimelico o D-lisina son relativamente frecuentes.
*     Los polisacáridos están unidos por enlaces covalentes (en el caso de tenerlos).
*     El contenido proteico es bajo.
*     Alto contenido de lípidos.
*     Bajo contenido de amino azucares.

GRAM NEGATIVO
*     La red de mureina presenta una sola capa.
*     La constitución de mureina es igual en todas las bacterias Gram negativas.
*     Contiene siempre únicamente meso-diaminopimelico.
*     Nunca contiene lisina.
*     No hay puentes interpeptidicos.
*     Hay gran cantidad de lipoproteínas y lipopolisacaridos que representan hasta el 80% del peso seco de la pared células.
*     Necesitan calcio para mantener la estabilidad de las capas de lipopolisacaridos, lo que las hace vulnerables a la lisozima.
*     No se ha podido demostrar acidos teicoicos.

METODOLOGIA
*    Recoger muestra
*    Hacer el extendido con un palillo de madera
*    Dejar secar a temperatura ambiente o fijarla utilizando un mechero
*    Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado tres veces aproximadamente)
*    Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar un minuto
*    Enjuagar con agua
*    Agregar lugol y esperar un minuto aproximadamente
*    Enjuagar con agua
*    Agregar alcohol acetona y esperar entre 5 y 30 segundos según la concentración del reactivo (parte crítica de la coloración). (las Gram (-) se decoloran y las Gram (+) no)
*    Enjuagar con agua
*    Tinción de contraste agregando safranina o fucsina básica y esperar un minuto. Este tiente dejara de color rosado – rojizo las bacterias Gram negativas
Para observar al microscopio óptico es conveniente hacerlo al 100 X con aceite de inmersión

EXPLICACION
El cristal violeta (colorante catiónico) penetra en todas las células bacterianas (tanto gram positivas como gram negativas) a través de la pared bacteriana. El lugol es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio) y SI (Siulterio), los cuales están presentes para solubilizar el yodo y actúan de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la célula bacteriana. El I2 entra en las células y forma un complejo insoluble en solución acuosa en el cristal violeta.
La mezcla de alcohol – cetona que se agrega, sirve para realizar la decoloración, ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos gram positivos no se decoloran, mientras que los gram negativos si lo hacen.
Para poner de manifiesto las células Gram negativas se utiliza una decoloración de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina. Después de la coloración de contraste las células Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen violeta.
La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la técnica. Sirve para hacer una tinción de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas. Al termino del protocolo, las Gram positivas se verán azul – violáceas y las Gram negativas, se verán rosas (si no se hiso la tinción de contraste) o rojas (si se usó, por ejemplo, safranina).
Esta importante coloración diferencial fue descubierta por Hans Christina Gram en 1884. En este método de tinción, la extensión bacteriana se cubre con solución de uno de los colorantes de violeta de metilo, que se deja actuar durante un lapso determinad. Se escurre luego el exceso de violeta de metilo y se añade luego una solución de yodo, que se deja durante el mismo tiempo que la anterior; después se lava el portaobjetos con alcohol hasta que este no arrastre más colorante. Sigue a tal tratamiento una coloración de contraste, como safranina, fucsina fenicada diluida, pardo Bismarck, pironin B o hasta inclusive verde malaquita.
Algunos microorganismos retienen el colorante violeta, aun después de tratarlos con un decolorante y el color no se modifica al añdir este; otros pierden con facilidad el primer tinte, y toman el segundo. Los que fijan el violeta se califican de gram positivos y los que pierden la primera coloración y retiene la segunda de gram negativos. Basándonos pues, en la reacción gram, podemos clasificar a los microorganismos en uno de los dos grupos. Los colorantes de p-rosanilina son los que mejores resultados dan en la coloración gram. los representantes mas usados de este grupo son violeta de metilo y violeta cristal o de genciana. En realidad, violeta de metilo es el nombre atribuido al compuesto tetrametil – p – rosanilina.
El matiz de color de la p – rosanilina se intensifica al aumentar el numero de grupos metilo en la molecula; por consiguiente, de los tres grupos, el tono mas oscuro es la hexametil – p – rosanilina (violeta cristal), y el tinte mas ligero, la tetrametil – p – rosanilina (violeta de metilo). Los nombres violeta de metilo 3R, 2R, R, B, 2B, 3B, etc., se refieren al número de grupos metilo contenidos. La letra R indica matices rojos, y la letra B, tonos azules. El violeta de cristal contiene seis grupos metilo y se considera como el mejor colorante primario para teñir por el método de Gram.
La facultad de las células para tomar la coloración Gram no es propia de toda sustancia viviente,  sino que se limita casi en absoluto a hongos y bacterias. Así vemos que las células de plantas y animales superiores no conservan la primera coloración; los mohos se tiñen con cierta irregularidad; los gránulos de micelios propenden detener el colorante. La reacción de Gram no es infalible ni constante; puede variar con el tiempo del cultivo y el pH del medio, y quizá por otras causas.

CONCLUSION
La tinción de Gram es útil para diferenciar entre las bacterias que poseen una capa gruesa de mureina o peptidoglicano de las que no, pues, quienes lo  tienen se tiñen de violeta designándolos como Gram positivos mientras que los Gram negativos se tiñen de rojo al tener una capa más delgada de mureina.
Los Gram negativos se tiñen de rojo gracias a la Safranina que se utilizó al final del procedimiento, porque no se fijan las primeras  sustancias  que utilizamos al principio del procedimiento que fue el Cristal Violeta y el lugol, debido a que cuando se le coloca el alcohol acetona se “limpia” nuevamente la muestra, y al aplicar la safranina adquiere fácilmente el color rojo de la sustancia.

Podemos fijar la muestra ya teñida al portaobjetos  pasándolo rápidamente sobre la llama de un mechero de bunsen cuidando no calentar demasiado el portaobjetos para no quemar a las bacterias de la muestra.


EVIDENCIAS





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